• Stefanie Valbon
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Je me souviens encore de mon premier cours d’immunologie, lorsque notre professeur a commencé à expliquer les différents types de cellules immunitaires. Il a dit que chaque cellule remplissait une fonction spécifique qui était déterminée par les protéines qu’elle exprimait. Cela semble assez facile, non ? Eh bien, ce n’était pas le cas dans mon esprit. Tout ce que je pouvais penser était: comment? Comment savoir quelles protéines une cellule exprime ? Comment distinguer la cellule A de la cellule B ? Je savais que nous pouvions voir différents types de cellules à l’aide de microscopes (ce qui, soit dit en passant, va certainement sur ma liste « étincelles de joie »). Mais je me demandais si c’était le seul moyen.

Il s’avère que j’ai vécu environ 22 ans de ma vie sans connaître une expérience appelée cytométrie en flux. Je sais, difficile à croire. Croyez-moi, la cytométrie en flux est l’une des expériences les plus utilisées par les immunologistes. Ainsi, apprendre comment cela fonctionne et comment lire ses résultats est crucial. Pour ceux qui ne sont pas encore familiarisés avec cet outil EXTRÊMEMENT puissant, cet article est pour vous. Comme toujours, préparez-vous à être émerveillé !

Cytométrie en flux : les bases

Je crois que pour que nous puissions comprendre n’importe quel concept scientifique, nous devons d’abord être confrontés à un problème. Voici donc le problème du billet d’aujourd’hui : imaginez que vous êtes un chercheur sur le cancer et que vous voulez déterminer quelles cellules immunitaires sont présentes à l’intérieur d’une tumeur spécifique. Pour ce faire, vous êtes en mesure de prélever un morceau de la tumeur pour faire votre analyse.

Disons que votre première pensée a été d’analyser ces cellules au microscope. Après avoir préparé l’échantillon, vous avez vu beaucoup de cellules, l’une à côté de l’autre. Oui, peut-être avez-vous vu des formes différentes, mais c’était à peu près tout. Votre question initiale, cependant, n’était pas d’analyser la structure cellulaire, mais de déterminer et de quantifier les différents types de cellules présentes à l’intérieur de la tumeur.

Alors, vous avez décidé de changer votre approche et de séparer chaque cellule les unes des autres. Cette excellente idée est la première étape nécessaire pour effectuer la cytométrie en flux. En séparant une cellule d’une autre (c’est-à-dire en préparant une suspension de cellule unique), vous diluez toutes les cellules dans une solution. Maintenant quoi? Il faut maintenant le caractériser.

Comme je l’ai mentionné précédemment, chaque type de cellule exprime une combinaison de différentes protéines. Disons qu’une cellule A exprime la protéine A et que la cellule B exprime la protéine B. Maintenant, vous avez juste besoin d’un outil, comme une étiquette, qui est très spécifique à la protéine A, et une autre qui est spécifique à la protéine B… vous voyez où Je vais avec ça, non ? Exactement! Notre corps est capable de générer de tels outils. Ceux-ci sont appelés anticorps et agissent comme des marqueurs pour aider notre système immunitaire à « étiqueter » les protéines des envahisseurs étrangers.

Les scientifiques étaient extrêmement intelligents et ils ont décidé d’utiliser cet outil immunitaire naturel à leur avantage. Ils ont généré des anticorps contre la protéine A et la protéine B (et contre un grand nombre d’autres protéines). Ainsi, si vous ajoutez une grande quantité d’anticorps contre la protéine A à votre suspension de cellule unique, il se liera aux cellules qui expriment la protéine A à leur surface. Étant donné que les anticorps sont généralement très spécifiques, vous pouvez désormais étiqueter (étiqueter) toutes les cellules exprimant votre protéine d’intérêt.

Maintenant, nous devons nous assurer que chaque anticorps différent « enverra un signal différent ». Cela signifie qu’un marqueur cellulaire avec l’anticorps A doit envoyer un signal différent d’un marqueur cellulaire avec l’anticorps B. Enfin, nous avons besoin d’une machine qui sera capable de détecter cette information et de nous la rapporter de manière simple. Voilà! C’est l’idée derrière la cytométrie en flux, très triviale, mais exceptionnellement puissante.

Comment ça marche réellement ?

La clé réside dans le « signal » envoyé par chaque anticorps. Les anticorps utilisés en cytométrie en flux (et dans de nombreuses autres expériences) sont modifiés pour avoir un marqueur fluorescent (appelé fluorochrome).

Une fois que vous avez ajouté votre échantillon marqué à la machine de cytométrie en flux, chaque cellule passera à travers un très petit tube. Une source de lumière laser frappera alors chaque cellule. Dès qu’une cellule marquée est touchée par le faisceau laser, elle émet des photons (ou particules lumineuses) qui peuvent être détectés par des capteurs présents à l’intérieur de la machine.

Une fois touchés par le faisceau laser, différents fluorochromes émettent des photons de différentes longueurs d’onde, qui sont détectés par des capteurs. Donc, si vous marquez la protéine A avec un fluorochrome et la protéine B avec un fluorochrome différent, la machine de cytométrie en flux est capable de différencier les cellules exprimant la protéine A de celles exprimant la protéine B. Cool, non ?

Une chose que vous devez comprendre à propos des scientifiques (et des scientifiques en devenir, comme moi), c’est que nous sommes cupides. On ne veut pas pouvoir séparer nos échantillons à l’aide de 2 anticorps différents… on veut utiliser 5… 10… 15 anticorps, pour pouvoir étudier en profondeur nos cellules préférées. Une autre caractéristique de presque tous les scientifiques est que nous sommes toujours occupés. Nous avons tellement d’expériences à mener, de données à analyser et de café à boire que nous ne pouvons pas perdre de temps. On veut pouvoir analyser… 10 000 cellules par seconde… ça parait raisonnable ! Certaines machines de cytométrie en flux sont capables de faire exactement cela, et c’est pourquoi nous les aimons !

À quoi ressemblent les données ?

Si vous avez déjà lu un article de recherche en immunologie, vous avez probablement vu un graphique qui ressemble beaucoup à ceci :

Lire ce graphique est un jeu d’enfant ! Chaque petit point bleu représente une seule cellule qui a été détectée lors de son passage dans la machine de cytométrie en flux. La différence de couleur explique l’augmentation du nombre de points exactement au même endroit. En rouge, c’est là que vous trouverez la plus forte concentration de points (ou cellules) ensemble.

Le nombre au coin du graphique représente le pourcentage de cellules présentes dans le carré rose (également appelé déclenchement). Pour déterminer quelle protéine une cellule exprime, nous allons d’abord penser à l’axe des x et à l’axe des y séparément. Chacun d’eux sera utilisé pour quantifier une seule protéine.

Donc, dans notre cas, l’axe des x quantifie la protéine A et l’axe des y quantifie la protéine B. Donc, si vous avez une cellule présente dans la partie inférieure droite du graphique, cette cellule exprime la protéine A, mais n’exprime pas la protéine B Si vous avez une cellule en haut à droite du graphique, elle exprime à la fois les protéines A et B. Et ainsi de suite…

Notez qu’une cellule exprime généralement bien plus qu’une seule copie d’une protéine. La « quantité » de protéine peut être mesurée par la distance à laquelle le point est présent par rapport à l’origine du graphique. Cela signifie qu’une cellule située au milieu de l’axe des abscisses exprime moins de protéine A qu’une cellule située à l’extrême droite du graphique.

Maintenant, vous devez vous demander, comment pouvons-nous tester plus de 2 protéines différentes ? Eh bien, lors de l’analyse des données de cytométrie en flux, vous pouvez en fait sélectionner (ou verrouiller) vos cellules d’intérêt pour une étude plus approfondie. Disons que vous vouliez vraiment analyser des cellules positives pour les protéines A et B (quadrant supérieur droit). Vous dessineriez alors une porte (un cercle dans notre cas, mais il peut être carré ou de toute autre forme) autour de cette population.

Une fois la population sélectionnée, vous pouvez changer d’axe pour analyser d’autres protéines. Imaginez que vous ayez également coloré votre échantillon avec des anticorps contre la protéine C et la protéine D. En plaçant la protéine C sur l’axe des x et D sur l’axe des y, vous pouvez analyser leur expression.

If you see cells at the top right quadrant, these cells are not only positive for protein C and D but also for A and B, since these were the cells you selected at first. And you can go on, and analyze different proteins and combinations of proteins in each cell population.

Moreover, with just a slight modification of the antibody staining procedure, you can also stain proteins present inside the cells, and even inside the nucleus of the cells, making this experiment even more powerful!

Can I collect my favourite cells in a tube?

But wait, it doesn’t stop here. What if you tell me: « Stefanie, I would really like to collect cells expressing A, B and C for further analysis ». Ambitious, I like it! If you truly love these cells and want to separate them from all the other cells (maybe to cultivate them, to extract protein, to extract DNA etc), you CAN! With an experiment called Cell Sorting.

During flow cytometry, after your cells pass through the tube and are hit by the laser beam, they go to waste. In this experiment, you only want the data (the graphs explained above), so as soon as you have the data, your cells go « bye, bye ». But during cell sorting, you can select the cells you want to collect, by gating around the population of interest (just like we did before) and telling the machine to sort. Therefore, only your favourite cells (the ones you gated) are physically collected in a tube. Mind-blowing, I know!

Taking all these amazing features together, you now know why flow cytometry and cell sorting experiments were essential to allow our science to advance at an extremely high speed. So, next time someone gives you a tube labelled « my favourite cells » you know how they did it!

Stay safe and I will see you next Tuesday!

Stefanie Valbon

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